作者：张昊华 北京积水潭医院

凝血酶衍生的C-末端肽（TCPs）约为2 kDa存在于伤口中，发挥抗内毒素功能。利用核磁共振波谱（NMR）、生物物理、质谱和细胞研究的结合以及硅多尺度建模，我们在此确定了HVF18（HVFRLKKWIQKVIDQFGE）的结合构象，与细菌脂多糖（LPS）复合，并定义了先前未公开的TCPs与人CD14之间的相互作用。此外，我们表明TCPs结合到CD14的LPS结合疏水袋，并鉴定了TCP与LPS和CD14相互作用的关键肽区。总之，我们的结果证明了结构转变在LPS复合物形成和CD14相互作用中的作用，为先前在细菌败血症和内毒素休克实验模型中观察到的TCPs治疗作用提供了分子解释。
Toll样受体4（TLR4）对脂多糖（LPS）的感应在感染的早期反应中至关重要，其中不受控制的LPS反应会导致过度的局部炎症，如感染伤口中的炎症，但也会导致感染的严重全身反应。因此，尽管LPS的感应对于最初的宿主防御反应很重要，但清除和控制这种分子对于避免过度炎症和器官损伤至关重要。例如，LPS触发NF-κB介导的组织因子上调，从而形成凝血酶，进而激活凝血和纤维蛋白形成，从而有助于初始止血和抵御细菌入侵。此外，中性粒细胞弹性蛋白酶对凝血酶的蛋白水解导致易于聚集的11 kDa C-末端片段，存在于伤口中，与LPS和革兰氏阴性细菌形成无定形淀粉样共聚集体，有助于随后通过吞噬作用清除这些聚集体。此外，凝血酶衍生的C-末端肽（TCP）约为2 kDa，如FYT21（FYTHVFRLKKWIQKVIDQFGE）和HVF18（HVFRLKKWIQKVIDQFE），存在于伤口液中，并已证明在体外和活体中发挥抗内毒素功能。这些较小的肽属于宿主防御肽（HDPs）9的不同家族，包括中性粒细胞衍生的α-防御素和组织蛋白酶LL-3710，它们都具有免疫调节活性。今天，迫切需要新的抗感染疗法。然而，目前基于抗生素的治疗仅针对细菌，而不是伴随的免疫反应过度激活。这种不受控制的刺激可能会导致炎性细胞因子的大量产生，从而导致全身炎症、血管内凝血和器官功能障碍，如sepsis所示。仅在美国，这是一个主要的死亡原因，每年估计有超过70万例病例，死亡率从28%到60%。因此，基于自然自身固有防御策略的治疗理念，不仅针对细菌，还针对过度免疫反应，可能具有巨大的治疗潜力。例如，许多天然存在的HDP以及LPS识别蛋白片段显示出对LPS的强烈亲和力，阻断了与LPS结合蛋白（LBP）的下游相互作用，从而减少了体外和体内细胞因子的产生。在实验动物模型中，HDPs中和循环LPS可减少LPS诱导的促炎作用。
包括先前在人类伤口中鉴定的天然TCPs序列6，已被证明在体外中和LPS，并在实验动物模型中预防铜绿假单胞菌败血症和LPS介导的休克，主要通过减少全身细胞因子反应。假设地，可以认为仅仅通过清除LPS结合就可以解释观察到的肽效应。然而，具有相同组成但重组序列的TCP变体（WFF25）产生了具有保留（甚至更高）LPS亲和力的线性两亲结构，尽管其具有更高的LPS和脂质a结合，但在体外和体内既没有显示细胞结合和摄取，也没有任何抗内毒素作用。此外，电子显微镜研究表明，TCPs与LPS在单核细胞表面共定位，随后与LPS内化，没有任何伴随的TLR4二聚和下游NF-κB活化。此外，用TCPs预孵育，然后加入LPS产生类似的效果，提示细胞依赖性活性。这些观察结果表明，除了LPS外，TCPs还存在其他靶点，这与先前观察到的结构非特异性LPS结合不是HDP抗内毒素作用的充分要求一致。在这种背景下，我们开始在分子水平上表征这些TCPs抗内毒素作用的结构先决条件。
在此，通过NMR分析，我们确定了TCP HVF18与LPS复合物的结合构象。HVF18-LPS结构包括一个C端螺旋和一个延伸的N端，带有一个有利于弯曲骨架折叠的β-圈，赋予疏水核的C形两亲排列，内衬两个亲水簇。此外，使用硅对接、微尺度热泳（MST）分析和化学交联以及质谱分析的组合，我们表明TCPs结合到人CD14的氨基末端疏水性LPS结合袋。此外，我们观察到LPS对CD14的亲和力在TCPs的存在下降低，这说明了TCP作用的竞争性质。总之，我们定义了TCP与LPS和CD14的相互作用，并为先前观察到的TCPs在体外和体内的抗内毒素作用提供了详细的解释。