凝固酶选择性金属蛋白酶3组织抑制剂（TIMP3）对骨性关节炎手术小鼠模型关节软骨的保护作用
作者：唐浩 北京积水潭医院

在OA中使用具有广泛抑制活性的金属蛋白酶抑制剂（如TIMPs）的临床试验强调了对肌肉骨骼系统的非靶向效应，这是一种更为特异的靶向治疗方法。Robin Poole及其同事在20世纪90年代早期进行的定量免疫化学分析表明，骨性关节炎中的聚集蛋白聚糖经历了关节软骨发生的两个阶段的病理变化；早期主要为退行性阶段I，随后为净修复阶段II。然而，尽管在阶段II中大量替换降解的蛋白多糖，但由于软骨胶原纤维暴露于胶原酶，OA的发展和进展导致这些分子的净损失。
因此，目前OA发病机制的主要焦点之一是提供不同种类酶的特异性抑制，以评估聚集酶与胶原酶抑制在OA发病和进展中的作用，从而导致关节功能受损。在这项研究中，我们测试了在关节软骨保护中抑制聚集酶是否比使用胶原酶和聚集酶的广谱抑制剂更有效。为此，我们使用了TIMP3的变体[-1A]TIMP3，它提供了对ADAMTS-4和-5以及ADAM-17（TACE）18和TIMP3（抑制聚集酶和胶原酶，也抑制其他adamalysins，包括ADAM-1024、-12S25和-17（TACE）26）的选择性抑制。虽然还不完全了解在分子的N端添加额外的丙氨酸是如何实现这种选择性的，但结构模型表明，TIMP3与MMPs的活性位点紧密吻合，在N端添加丙氨酸导致活性位点中抑制剂的构象不同，以适应额外的残基。据推测，丙氨酸的添加使[-1A]TIMP3相对于TIMP3向后倾斜。因此，在ADAMTS-4和-5中，蛋白酶保留了足够的接触位点以允许结合，胶原酶则不是这样。另一方面，[-1A]TIMP3对ADAMTS-4的抑制活性略有降低。ADAMTS-5未观察到这种降低。这些数据表明，TIMP3的N末端区域参与抑制ADAMTS-420，而N末端区域对抑制ADAMTS-5没有必要。最终，[-1A]TIMP2是ADAMTS-51的相对特异性抑制剂。
我们利用Col2a1基因的软骨细胞特异性启动子/增强子，在软骨中特异性地产生了过度表达[-1A]TIMP3或TIMP3的转基因小鼠。虽然成熟的[-1A]TIMP3-Tg小鼠的关节软骨组织学观察结果与TIMP3-Tg小鼠或非转基因WT小鼠相似，但与类似于非转基因WT-小鼠的[-1A]TIMP3 Tg小鼠相比，TIMP3-T小鼠的皮质室和小梁网络的骨结构出现了显著的形态学变化。这些结果很可能是因为TIMP3过度表达代表了一个抑制广泛MMPs的系统，可以影响骨内稳态。因此，尽管使用具有类似表达水平的[-1A]TIMP3和TIMP3的转基因小鼠，MMPs的抑制似乎会损害骨功能，正如我们之前所展示的，并且在MMP-1328和MMP-14敲除小鼠29的骨骼异常中表现明显。同样，MMP-2-和MMP-3-敲除小鼠表现出比野生型小鼠更严重的关节炎。此外，MMP-14缺乏会由于胶原蛋白溶解活性的消融而导致关节炎，这对于骨骼结缔组织的建模至关重要。值得注意的是，TIMP3抑制ADAM家族中控制一系列细胞信号通路的酶的成员。ADAMs是否在骨骼形成中起作用目前尚不清楚。因此，在这些实验中不能排除TIMP3过度表达对ADAMs活性的可能影响。
此外，为了理解为什么与[-1A]TIMP3 Tg小鼠相比，小鼠中TIMP3的过度表达并不能同样地保护软骨免受降解，必须对骨完整性进行研究，因为抑制剂水平的增加会导致骨骼异常27。事实上，使用Col2a1或Sox9启动子来驱动软骨表达的一个警告是，这些基因也在骨骼中表达，这在发育过程中的谱系追踪实验中得到了证明。同样，我们之前报道过，TIMP3过表达转基因纯合小鼠表现出骨缺陷27。在这项研究中，与TIMP3小鼠不同，[-1A]TIMP3鼠没有表现出骨微结构缺陷，这很可能是因为在发育过程中似乎没有骨缺陷与聚集酶缺乏相关。此外Khokha实验室34最近的一项研究使用遗传方法，通过交叉Chloe或Jaffa敲入突变来检测聚集蛋白聚糖裂解对TIMP缺陷小鼠骨骼异常的作用，这些突变阻断聚集蛋白聚糖IGD中MMP（Chloe）或ADAMTS（Jaffa）裂解位点表明天然金属蛋白酶抑制剂是软骨细胞的关键调节器成熟程序、生长板完整性和骨骼比例。
在本研究中，TIMP3变异体[-1A]TIMP3的引入为OA的治疗提供了一种新的治疗方法。它还强调了针对关节软骨的酶种类之间的差异。虽然抑制凝集酶可以维持蛋白聚糖裂解并保护胶原蛋白变性，但II型胶原蛋白含量和裂解之间存在反向关系。虽然蛋白聚糖可以在OA软骨中新合成，但II型胶原蛋白的合成与降解之间缺乏相关性，这表明在病理状态下，后方面的转换并不协调；因此，有必要保持聚集蛋白聚糖的完整性，以尽量减少II型胶原蛋白的降解。
MMP抑制剂临床试验中观察到的最常见副作用是MSS的发展，表现为肩关节疼痛和静止不动、关节痛和手部挛缩。之前已经建立了MSS的动物模型，该模型专门关注关节发育，并且在组织病理学上与使用MMP抑制剂治疗的人类患者的观察结果相似。我们的研究明确表明，与TIMP3不同，[-1A]TIMP3的过度表达没有影响骨骼形成的靶外效应，并且在骨性关节炎的DMM模型中，它可以通过抑制凝集酶来保护关节软骨免受降解。一旦软骨已经降解，TIMP3 Tg或[-1A]TIMP3-Tg小鼠中的降解是否可以停止，这一点在OA15诱导的MMP-13敲除小鼠中已经得到证实，仍有待研究。为此，未来必须生成一个诱导系统，在成年小鼠损伤开始后，在所需的时间点表达这些转基因。