作者：朱瑶 北京积水潭医院

IVA型粘多糖病（MPSIVA）或Morquio A病是一种溶酶体储存障碍，由N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶（GALNS）缺乏引起，导致硫酸角质形成素（KS）和硫酸软骨素-6-积累。患者会出现严重的骨骼发育不良、早期软骨退化以及危及生命的心脏和气管并发症。没有治愈方法，酶替代疗法不能纠正骨骼异常。在这里，使用CRISPR/Cas技术，我们生成了第一个MPSIVA大鼠模型，该模型概括了患者经历的所有骨骼和非骨骼改变。用编码Galns（AAV9 Galns）的腺相关病毒载体血清型治疗MPSIVA大鼠导致骨、软骨和周围组织的广泛转导。这导致GALNS活性的长期（1年）增加和KS水平的全身校正，从而防止了身体尺寸缩小和骨骼、牙齿、关节、气管和心脏的严重改变。这项研究证明了AAV9 Galns基因治疗在纠正失能性MPSIVA病理学方面的潜力，为将来临床应用于MPSIVA患者提供了强有力的理论依据。
IVA型粘多糖病（MPSIVA；Morquio A病：OMIM#253000）是一种常染色体隐性溶酶体储存障碍（LSD），由N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶（GALNS，EC 3.1.6.4）缺乏引起。这种酶的缺乏导致糖胺聚糖（GAG）硫酸角蛋白（KS）和硫酸软骨素-6-硫酸（C6S）的积累。在MPSIVA患者中，未分级的KS和C6S的病理性积累，主要在软骨细胞和软骨细胞外基质中，改变了软骨和骨的发育，导致异常的软骨生成和软骨内骨化。大多数患者的早期症状，包括骨骼发育不良，可在年轻时（平均年龄2.1岁）检测到。其他非骨骼表现为呼吸并发症和瓣膜性心脏病。
根据GALNS基因突变的不同，临床病理学在不同患者之间存在显著差异，从严重且快速进展的早发型到缓慢进展的晚发型不等。30多个基因改变与表型减弱相关，而100多个突变导致人类患者和出现严重改变。其中，携带最常见和最严重的人类错义突变c.1156C>T的患者，其导致GALNS蛋白中的p.Arg386Cys ，在基因型和表型之间显示出明显的相关性。
MPSIVA疾病的治疗具有挑战性，因为骨病理学的早期发病以及治疗难以到达孤立的靶组织，如无血管软骨。对于大多数患者来说，疾病的控制仅仅是症状性的，目的是改善他们的生活质量。Morquio A病的第一个批准治疗是酶替代疗法（ERT），一种改良的重组人GALNS（VIMIZIM®） 即使对年轻患者使用ERT，也无法纠正骨骼和超声心动图的改变。由于骨骼发育不良是Morquio A病的主要特征，因此需要新的治疗方法来治疗骨骼和软骨。与其他由分泌溶酶体酶缺陷引起的遗传疾病一样，MPSIVA也是基因治疗方法的候选。用腺相关病毒（AAV）载体进行体内基因转移可以克服ERT相关的限制，因为转导的细胞将允许持续产生可用于交叉校正细胞的活性酶。此外，AAV载体在体内显示了高转导效率、治疗基因表达的长期耐久性以及临床研究中非常好的安全性。
为了开发MPSIVA疾病的基因治疗，一个限制是，现有的MPSIVA小鼠模型均未发展出Morquio a患者的严重和致残的骨骼和关节病理。用基于肝导向AAV的基因治疗对MPSIVA鼠进行治疗，导致GALNS分泌增加，血浆、肝脏和肺中KS水平正常化。然而，由于MPSIVA小鼠模型中缺乏骨骼发育不良，因此无法评估AAV基因治疗方法在骨骼系统中的治疗效果。复制人类疾病的动物模型的可用性对于开发有效的治疗方法至关重要。对于其他疾病，包括骨骼疾病，大鼠模型显示的表型与人类病理改变非常相似。
在本研究中，为了克服MPSIVA小鼠模型的局限性，我们使用CRISPR/Cas9技术制作了MPSIVA大鼠模型。这只MPSIVA大鼠完全模仿了人类MPSIVA患者中发现的严重骨骼和非骨骼改变，因此代表了评估Morquio A病新治疗方法的最相关模型。在这方面，在MPSIVA大鼠中，我们已经证明，AAV9载体与普遍存在的CAG启动子结合使用可介导Galns在骨骼、软骨中的广泛表达，并最终在所有受Morquio A病影响的关键外周器官中广泛表达。我们发现AAV9 Galns治疗可以纠正MPSIVA大鼠严重的全身改变，特别是骨骼发育不良和软骨退化。在这项工作中，我们证明了AAV9 Galns基因疗法治疗MPSIVA的有效性和长期耐久性，为将来治疗其他骨骼受累疾病奠定了基础。
使用CRISPR/Cas9技术生成了携带最常见和最严重人类错义突变c.1156C>T的MPSIVA大鼠模型，该突变导致GALNS蛋白7,9中的p.Arg386Cys。通过PCR和Sanger测序分析确认了Galns基因的靶向性。Galns之间进行了三次选择性回交+/− 和WT大鼠消除CRISPR/Cas9相关的靶外事件32,33.Galns+/− 来自两个不同品系（L1和L2）的大鼠具有相似的循环GALNS活性。盖恩斯−/− L1和L2大鼠表现出不可区分的表型（缺乏GALNS活性、肝脏KS含量高、体重减轻（约50%）和鼻肛长度（约20%）。L2加仑−/− 选择大鼠以进一步表征MPSIVA大鼠模型。这些大鼠在所分析的所有组织中均显示出无法检测到的GALNS活性水平，早在1个月大时，肝脏和血清中KS含量持续升高，胫骨长度缩短，这是Morquio a病的主要特征。