作者：施云威 北京积水潭医院

骨髓间充质干/基质细胞（BMSCs）的脂肪细胞分化而非成骨细胞的形成导致了年龄和更年期相关的骨髓肥胖症和骨质疏松症。血管钙化常与骨质疏松症发生，这一矛盾的关联被称为“钙化悖论”。我们发现，在骨吸收过程中，来自老化骨基质（AB-EV）的细胞外囊泡有利于BMSC脂肪生成，而不是骨生成，并增加血管平滑肌细胞的钙化。静脉或髓内注射AB EVs可促进年轻或老年小鼠的骨脂肪失衡，并加剧维生素D3（VD3）诱导的血管钙化。阿仑膦酸盐（ALE）是一种骨吸收抑制剂，可下调AB EVs的释放，减轻衰老和卵巢切除引起的骨脂肪失衡。在VD3治疗的老年小鼠中，ALE抑制卵巢切除引起的血管钙化的加重。MiR-483-5p和MiR-2861富含AB EV，对于AB EVs诱导的骨脂肪失衡和血管钙化的加剧至关重要。我们的研究通过转移miR-483-5p和miR-2861揭示了AB-EV作为钙化悖论信使的作用。
骨质疏松症是一种骨疾病，其特征是由于骨代谢不平衡而导致骨量低和骨质量差，常发生于老年人，尤其是绝经后妇女。骨髓间充质干/基质细胞（BMSCs）向脂肪细胞的不平衡分化以成骨细胞为代价，对年龄和更年期相关的骨髓肥胖症和骨质疏松症起着重要作用。血管钙化是一种与骨形成有许多共同特征的病理过程，通常伴随着骨量减少或骨重塑紊乱。这种相互矛盾的关联被称为“钙化悖论”。然而，钙化悖论背后的机制尚未完全理解。
外泌体为40–150 纳米细胞外囊泡（EVs）来源于多囊泡体，通过将生物活性成分，如蛋白质、信使RNA（mRNA）、微RNA（miRNA）和基因组DNA转移到受体细胞，在细胞间通信中发挥关键作用。骨基质囊泡是位于骨基质内的纳米尺寸EVs，为骨矿化提供初始位置。骨基质囊泡和外泌体在大小、形态和成分（蛋白质和脂质）方面的相似性表明，骨基质囊是由骨细胞分泌的锚定外泌物。由于绝大多数文献中的术语“外泌体”通常指的是具有外泌体内某些生化或生物物理特征的EV，而没有证明其细胞内来源，因此我们选择使用通用术语“EV”而不是“外泌体”。目前，主要负责骨基质EVs（B-EVs）产生的细胞类型尚不清楚。还缺乏证据表明B-EV是否与年龄和更年期相关的BMSC命运转换和骨脂肪失衡有关。
与骨细胞一样，血管平滑肌细胞（VSMC）也可以产生基质EV样结构13。矿化VSMC的基质EV含有较少的基质Gla蛋白（一种矿化抑制剂），并且比在生理条件下分泌的基质囊泡具有更高的促进矿物成核的能力，这表明基质EV参与了血管钙化。研究表明，在破骨细胞骨吸收过程中，沉积在骨基质中的多种生长因子可以释放到骨髓中，然后参与骨稳态的调节，提示B-EVs可能被释放到骨髓中，然后进入循环，从而在骨骼老化和更年期引起钙化悖论。
在本研究中，我们通过将特定的miRNA转移到骨髓基质干细胞和血管平滑肌细胞，揭示了老化骨基质（AB-EV）中的EV作为钙化悖论信使的作用。首先，我们从老年人和年轻人或大鼠中分离出B-EV，并评估这些囊泡的外泌体特性。然后，我们研究了B-EVs的细胞来源，并比较了AB EVs和来自年轻骨的EVs（YB EVs）对BMSC成骨和成脂分化以及VSMC钙化的体外作用。在体内，我们测试了AB EVs是否能促进年轻或老年小鼠的骨脂肪失衡并加剧维生素D3（VD3）诱导的血管钙化。此外，我们评估了阿仑膦酸盐（ALE），一种广泛用于骨质疏松症治疗的骨吸收抑制剂，是否能够减少AB EVs的释放，减轻老年卵巢切除（OVX）小鼠的骨脂肪失衡和VD3诱导的血管钙化。同时，基于miRNA表达谱筛选可能介导AB EVs诱导的骨髓脂肪积聚和钙化悖论的候选miRNA，并在体外和体内证实其介导作用。
YB EVs和AB EVs分别从年轻和老年人骨标本中分离。在透射电子显微镜（TEM）下观察，YB EV和AB EV表现出杯状形态。纳米颗粒追踪分析（NTA）显示，YB EV和AB EV的平均直径为109.1±38.5 nm和101.9±34.6 流式细胞术分析表明，绝大多数（>97%）分离的YB EV和AB EV表达了包括CD63、CD81和TSG101在内的外体标记物，这进一步表明了这些囊泡的外体身份。外泌体特异性地富含来自其母细胞的许多分子，并且还表达对其母细胞特异的标记蛋白。进行流式细胞术分析以评估SOST（主要由骨细胞生成的糖蛋白蛋白）、I型胶原（COL I，成骨细胞标记蛋白）、，在YB EVs、AB EVs、骨细胞衍生EVs（OCY EVs）、成骨细胞衍生的EVs（OB EVs）和肥大软骨细胞衍生的EVs（HYPC EVs）中的X型胶原（COL X，肥厚软骨细胞的表型标记）。结果表明，SOST蛋白在YB EV、AB EV、OCY EV和HYPC EV中表达，但在OB EV中不表达。COL I和COL X分别在绝大多数OB EV和HYPC EV中表达，而OCY EV对此蛋白呈阴性。极少数（<10%）YB EV和AB EV对COL I和COL X呈阳性。这些结果表明，大多数B-EV是从骨细胞释放的，但不是从成骨细胞或肥大的软骨细胞释放的。