作者：宋洋 北京积水潭医院

关于巨噬细胞基因表达的研究历来集中于导致RNA聚合酶II募集和转录启动的事件，而启动后步骤对巨噬细胞激活的贡献仍知之甚少。在这里，我们报道了广泛的启动子近端RNA聚合酶II在静息巨噬细胞中暂停的标志是负延伸因子（NELF）复合物的共定位，并由PU促进。在炎症刺激时，超过60%的活化转录组受聚合酶暂停释放和染色质的瞬时全基因组NELF解离的调节，出乎意料地，独立于CDK9（一种推测的NELF激酶）。巨噬细胞中NELF的遗传破坏增强了编码Fos和Jun的AP-1的转录，从而增强了包括Il10在内的AP-1靶点的转录。IL-10（一种关键的抗炎细胞因子）的表达增加，反过来减少了促炎介质的产生，最终减少了体内巨噬细胞介导的炎症。总之，这些发现确立了NELF在抑制炎症抑制剂的转录从而使炎症巨噬细胞活化方面先前未被认识到的作用。
炎症已演变为对环境线索的快速反应，并导致一系列生理和病理过程，包括宿主防御、组织损伤和代谢变化。炎症的潜在有害影响需要存在精确的调节机制来控制其大小和持续时间。事实上，巨噬细胞的激活是炎症反应的一个重要组成部分，在多个层面受到严格的控制。例如，在激活过程中，巨噬细胞转录组经历了大量的重编程，数百个基因快速上调和下调了数百甚至数千个折叠，将转录作为这些细胞中调控电路的关键节点。巨噬细胞激活通常由细胞表面或内体受体的连接触发，其启动细胞内信号传导，最终导致序列特异性转录因子和RNA聚合酶（Pol）II募集到靶基因loci。历史上，Pol II募集和转录起始被认为是基因激活的主要限速步骤。然而，这一观点后来受到了几项研究的挑战，这些研究报告称，在静息巨噬细胞中，许多炎性基因（如Tnf）的转录起始位点（TSS）被Pol II9,10预加载，这提高了其激活的限速步骤发生在转录起始后的可能性。
事实上，最近主要在果蝇和干细胞中进行的许多研究都描述了Poll II启动子——近端暂停、暂停释放和进入生产性伸长同样容易受到调。具体而言，在形成预引发复合物（PIC）后，Pol II启动转录，合成短（20-60 nt）新生RNA，然后暂停。进一步的生产性伸长需要信号依赖性暂停释放，以将Pol II动员到基因体区域。鉴于Pol II暂停的重要性，暂停的建立及其释放受到过多的积极和消极因素的高度调节，包括负延伸因子（NELF）、DRB敏感性诱导因子（DSIF）和正转录延伸因子-b（P-TEFb）。在源自生化研究的经典暂停释放模型中，四亚基NELF复合物结合并将Pol II保留在启动子近端区域。暂停释放被认为是由细胞周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）和细胞周期蛋白T1组成的异二聚体P-TEFb复合物对NELF的信号诱导磷酸化所触发的，这导致NELF从启动子中消失。此外，P-TEFb磷酸化DSIF，将其从暂停转化为延长促进因子，并在Pol II C末端结构域（也被CDK12靶向）中的七肽重复序列中的丝氨酸2残基，这被认为共同促进Pol II进入基因体并产生转录延长。
转录的启动后调控涉及关键的生物学过程，包括胚胎发生和发育。启动后机制对免疫细胞功能的贡献尚未得到广泛认可，尽管一些开创性研究已经提供了强有力的证据，证明存在这种类型的调节，特别是在对环境线索快速反应的细胞如巨噬细胞中。TLR4的连接，然后是NF−kB募集，导致P-TEFb与许多基因位点结合。事实上，我们和其他人的研究表明，P-TEFb负载和转录延长是如何被炎症的负调节因子（包括糖皮质激素受体和其他转录抑制因子）靶向的，这突出了早期延长期间免疫基因调节的生理重要性。尽管如此，这些研究主要集中于感兴趣基因的特定亚群，而转录对巨噬细胞激活的启动后控制的特征和全球影响仍有待深入研究。
在这里，通过采用基因组、药理学和生物化学方法，我们全面绘制了巨噬细胞激活过程中启动后转录景观。我们描述了巨噬细胞炎症激活过程中“暂停因子”NELF与染色质的惊人的全局和动态相互作用，以及谱系决定转录因子PU.1对这一过程的意外贡献。利用巨噬细胞中Nelfb的基因破坏，我们鉴定了一组功能和转录多样的NELF调节基因，这些基因对炎症信号做出异常反应，并定义了一种将NELF直接转录控制下的暂停基因与其免疫系统中下游效应器连接起来的途径。最后，我们描述了体内巨噬细胞特异性NELF耗竭的后果，从而确立了NELF在哺乳动物炎症反应中的生理作用。
为了全面定义与小鼠原代骨髓源性巨噬细胞（BMDM）中信号诱导转录相关的全局Pol II暂停模式，我们进行了Pol II染色质免疫沉淀，随后进行了高通量测序（染色质免疫共沉淀（ChIP）-seq）和精确核运行测序（PRO seq）。在10076个由RNA-seq（下文称为“BMDM转录组”）定义的BMDM中表达的独特基因中，绝大多数基因显示了启动子-近端暂停的特征，如根据TSS区域与基因体区域中的Pol II ChIP-seq信号计算的高暂停指数（PI）所定义的。高度暂停（PI ≥ 3，第1组）和适度暂停（1.5 ≤ 圆周率 < 3，第2组）基因占BMDM转录组的76%，而非暂停基因占24%（PI < 1.5，第3组）。全局Pol II暂停模式在独立的ChIP-seq数据集上具有高度的可重复性（补充图1c）。为了检查暂停的Pol II是否具有转录活性，我们使用了检测从头转录的PRO seq，并在静息BMDM中发现了丰富的启动子近端短转录。有趣的是，基于PRO seq的定量还揭示了约83%的转录组中的启动子近端暂停，其与ChIP seq定义的Pol II暂停在很大程度上重叠。因此，静息BMDM中Pol II的占用和新生转录物的产生都证实了启动子近端暂停是一种普遍现象，影响了约四分之三的BMDM转录组，与其他物种和细胞类型中报道的Pol II暂停现象一致。