作者：郗扬 北京积水潭医院

颞下颌关节（TMJ）骨性关节炎（OA）是一种常见的疾病，其特征是关节咔哒声、张口受限和疼痛，对患者的日常生活有巨大影响。虽然颞下颌关节OA的潜在机制尚不清楚，但软骨下骨变性是颞下颌骨OA发育过程中的主要病理变化。在软骨下骨退化过程中，一方面，血管的生成导致严重的软骨退化。另一方面，各种炎症因子的释放和致敏因子的诱导导致TMJ神经的外周致敏和中枢致敏，从而发生疼痛。
活化破骨细胞通过降低骨密度和扰乱软骨下骨结构在软骨下骨变性中发挥作用。Netrin-1是一种具有化学吸引力的轴突引导蛋白，能够促进轴突伸长，是一种分泌蛋白，对轴突定向、细胞迁移、形态发生和血管生成具有较强的趋化性。已发现Netrin-1参与破骨细胞分化。破骨细胞前体细胞增加了Netrin-1的分泌，并通过自分泌或旁分泌途径促进破骨细胞的分化，富含纤维连接蛋白亮氨酸的跨膜蛋白2（Flrt2）通过干扰Netrin-1-Unc5b相互作用调节破骨细胞的多核化。
同时，Netrin-1还作为一种有效的血管分裂原在血管生成和炎症中发挥作用，可以促进血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖、迁移和粘附。此外，由于Netrin-1的轴突导向功能，它可以诱导软骨下软骨骨中神经轴突的生长，因此导致OA小鼠中背根神经节的兴奋和疼痛的超敏。Netrin-1在磨损颗粒诱导的骨溶解炎症模型中也高度表达。此外，单克隆抗体阻断Netrin-1及其受体已被证明可防止骨破坏并降低关节炎的严重程度。就TMJ OA而言，Netrin-1的作用尚不清楚。在本研究中，揭示了Netrin-1在TMJ OA中的表达，并研究了其在颞下颌关节OA进展中的可能作用。
从40名颞下颌关节紊乱病患者获得滑液，并根据他们自己的颞下颌关节疼痛记录视觉模拟量表（VAS）评分。将40例患者分为两组。他们是关节盘移位（ADD）组（n = 24）和骨关节炎（OA）组（n = 16). 对于ADD组，诊断主要基于临床检查，MRI和关节造影证实关节盘移位。锥形束计算机断层扫描（CBCT）显示髁突没有破坏。对于OA组，诊断主要基于临床检查，CBCT显示髁突有破坏。收集滑液的方法如前所述。用含有2 ml生理盐水的5 ml注射器将生理盐水注入颞下颌关节腔后，共提取2 ml稀释滑液，并冲洗3次。通过人ELISA试剂盒（HM11241；Bioswamp，中国武汉）测定滑液中Netrin-1的含量。该方法根据制造商的方案进行。
40只8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组和MIA组。小鼠的分组和治疗没有盲法。腹腔注射戊巴比妥钠后，触碰小鼠的耳前区以感觉颧弓；下面是TMJ腔。用70%乙醇对耳前区和颧弓进行消毒后，用1毫升注射器将针注射到颧弓和颞骨交界处的上前部，并缓慢向后和向下注射，以便判断针已插入关节腔。对于MIA组，小鼠一侧颞下颌关节注射20μL浓度为1 mg/50μL的MIA。最后，通过腹腔注射过量的戊巴比妥钠溶液对小鼠实施安乐死。上述小鼠治疗的顺序是随机的。所有治疗均在武汉大学口腔医学院和医院的无特定病原体（SPF）动物实验室进行。
冯·弗雷试验用于测量小鼠所经历的疼痛。硬塑料尖端用于刺激小鼠头部和面部的眼睛和耳朵之间连接的中点。在实验操作过程中，机械刺激强度增加，同时观察小鼠行为。当观察到摩擦嘴或抓头等反应时，记录刺激强度（g）。每30秒重复5次手术，记录头部退缩阈值。然后，取平均值作为TMJ疼痛阈值。
注射后1、2、3和4周，每10只小鼠（其中5只来自对照组，5只来自MIA组）被安乐死。所有髁状突标本立即用4%多聚甲醛固定24小时。冲洗过夜后，每组取4个标本进行显微CT检测。然后，将所有标本在10%EDTA中脱钙两个月，脱水并包埋在石蜡中。将40例标本切片，进行组织学染色和免疫组化染色。
收集髁状突并用多聚甲醛固定24小时。冲洗过夜后，通过显微CT（德国SkyScan1176）分析髁状。在50 kV和500µA条件下，相机像素尺寸为12.59μm。图像像素尺寸为9μ。对颞下颌关节髁头进行三维重建以观察骨变化，并使用CTAn、CTvox和DataViewer等显微CT分析软件获得BV/TV、Tb。Th和Tb。N值来比较骨结构的破坏。
将标本切成4μ。苏木精伊红（H&E）染色和甲苯胺蓝（T.B）染色。如前所述，测量软骨厚度、软骨细胞数量和蛋白聚糖面积。选择小鼠髁的功能表面，即与关节盘前部和中间区域相对应的髁区域，将该区域划分为三个部分，然后测量每个部分的软骨厚度，最后取平均值作为软骨厚度。使用ImageJ计数软骨细胞的数量和蛋白聚糖区域。Mankin评分评估HE染色显示的软骨表面完整性、甲苯胺蓝染色显示的细胞和软骨基质状况。