作者：靳微 北京市朝阳区六里屯社区卫生服务中心(北京城建老年病医院)

MaPpt1的应激反应表型和毒力基本不受影响，ΔMaPpt1比其野生型亲本对紫外线照射更具抗性。数字基因表达谱揭示了参与分生孢子形成的基因网络的改变极化生长、细胞周期、细胞增殖、DNA复制和修复，以及一些重要的信号通路。我们的数据表明，Ppt1在蝗虫真菌病原体的发育和细胞过程中起着重要的作用。
材料与方法以天青杆菌CQMa102为野生型（WT）。真菌菌株通常在Czapek-Dox琼脂培养基（CZA）和四分之一强度的沙博罗德葡萄糖琼脂培养基中生长（1/4 SDAY，包括1%葡萄糖、0.25%真菌学肽酯、0.5%酵母提取物和2%琼脂，）。采用大肠杆菌JM109和农杆菌AGL-1进行常规克隆、质粒繁殖和真菌转化。
生物信息学分析真菌Ppt1在NCBI数据库中的同源物的氨基酸序列如下：红霉、黑僵菌、黑穗病菌、尖孢镰刀菌、白僵菌、蛹冬虫夏草、哈茨木霉、红霉、假红霉和禾本科蓝球菌。序列分析使用NCBI/DNAMAN V6软件进行基序扫描和氨基酸多重比对，然后使用MEGA7软件的最大似然法进行系统发育分析。使用SMART对MaPpt1的功能域进行分析。蛋白质结构预测使用瑞士模型自动建模模式生成，并使用QMEAN6评分进行评估
质粒构建和真菌转化构建目标基因破坏载体，用引物LF/LR和RF/RR扩增MaPpt1基因的5‘（1kb）和3’（0.9 kb）片段。扩增片段分别包含HindIII/XbaI和EcoRV/EcoRI位点。PCR反应采用KAPA HiFi热启动ReadyMix试剂盒进行。PCR产物按引物含量用限制性内切酶酶切，克隆到含有谷磷酸铵性基因（bar）的质粒pK2-PB的各自位点，得到pK2-PB-MaPpt1L/R。为了构建互补载体pK2-sur-MaPpt1：：需要一个包含4.2kb的~片段，包括全长开放阅读框（ORF）（~ 1.8 kb）利用引物对FF/FR从WT基因组DNA中扩增出MaPpt1的上游启动子（~2.4kb）。然后，将PCR片段克隆到酶切的pK2-sur-egfp载体中，得到pK2-sur-MaPpt1：最终的载体（pK2-PB-MaPpt1L/R和pK2-sur-MaPpt1：：egfp）分别转化为根癌杆菌AGL-1用于真菌转化。在含有500 μg/ml谷氨酸铵的CZA上筛选mappt1破坏转化子（ΔMaPpt1），并使用引物L1/ PR和BF/R1进行PCR检测。在含有20 μg/ml氯脲乙基的CZA上筛选互补转化子。利用引物QF/QR和实时定量PCR，进一步证实了mappt1的破坏和互补转化子。以吖啶菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因Magpd作为内对照，采用引物Gpd-F/Gpd-R进行检测。
南方印迹执行南方印迹分析，3-5μg消化基因组DNA和DNA梯子分离1%琼脂糖凝胶，转移到尼龙膜，杂交，然后执行指令后罗氏挖掘高主要DNA标记和检测启动工具包我。使用引物Probe-F/Probe-R对探针进行扩增。
利用CM菌株分析了MaPpt1的亚细胞定位，并表达了一个表达MaPpt1：：eGFP融合蛋白的MaPpt1的亚细胞定位。表达式和通过荧光显微镜观察MaPpt1：：eGFP融合蛋白在分生孢子、芽管和菌丝中的亚细胞定位。
分生孢子萌发和分生孢子产量的测定分生孢子萌发和分生孢子产量的测定方法如前所述。简而言之，将WT、ΔMaPpt1和CM的分生孢子悬浮在无菌水中，然后通过四层透镜清洗纸过滤。将50微升的分生孢子悬液（1×107分生孢子ml/1）均匀分布在1/4 SDAY平板上，在28°C下孵育。每2.5 h检测分生花的发芽率，直到完全萌发每在显微镜下2小时观察分生虫萌发情况。将分生孢子产量评价的50 μl新鲜分生孢子悬液（1×107分生孢子/ml）分散在1/4 SDAY培养皿上，在28°C下培养。从第3天到第15天，每3天在1/4 SDAY平板上检测分生孢子的产量。
热休克和UV-B耐受性测定真菌对热和紫外线照射的耐受性根据Liu等人进行测定。比较WT、ΔMaPpt1和CM的IT50（萌发50%抑制时间）。简而言之，将100μl的分生孢子悬液（1×107分生孢子ml/1）放在无菌的埃彭多夫管中，置于45°C的水浴中浸泡0、2、4或6小时。热休克后，将20μl等分均匀分布在1/4 SDAY板上。在28°C下孵育24小时后通过显微镜观察，计算了分生孢子的发芽率。为了进行UV-B耐受性测定，将20μl的分生孢子悬液（1×107分生孢子ml/1）均匀分布在1/4 SDAY平板上。将平板立即暴露于1350 mW/m2的UV-B照射下0、3、6或9小时。培养皿在28°C下孵育24 h。通过显微镜观察，计算了分生孢子的发芽率。