作者：施云威 北京积水潭医院

尿液是非侵入性诊断标记物的理想来源。一些内在的和方法上的问题仍然阻碍了其作为液体活检基质的全部潜力。与血液不同，尿液浓度随营养、水合物和环境因素而变化。尿中富含来自泌尿生殖道的EV，而其保存、纯化和标准化可能会在个体间和个体内比较中引入EV亚群分析的偏差。本研究评估了减少这种偏差的方法，如适当和可行的尿液储存、从小量尿液中回收蛋白质和RNA的最佳一步EV纯化方法以及尿EV RNA定量分析的标准化方法。使用超离心、化学沉淀和免疫亲和力从冷冻或室温保存长达6个月的健康献血者尿液中分离EV。在尿样中比较多种尿液生化和EV参数，包括颗粒计数和蛋白质含量。为此目的，通过BCA、ELISA和WB分析进行纳米颗粒追踪分析（NTA）和蛋白质评估。这些测量值与通过RT-PCR评估的选定EV mRNA和miRNA的相对丰度相关，并根据反映和校正纵向尿样中EV含量变化的能力进行排序。所有纯化方法都能从少至1ml的尿液中回收EV并进行下游分析。我们的研究结果强调了在RT条件下尿液储存时EV RNA的长期稳定性，以及尿液中EV含量与一些常规测量的生化特征（如总尿蛋白和白蛋白）的良好相关性，但不包括通常用于尿液正常化的肌酐。EV分离物中mRNA和miRNA的比较评估揭示了特定RNA，特别是RNY4和小miRNA组，其水平很好地反映了样品间EV变异，因此可作为EV RNA含量的分析后标准化物。我们描述了一些现实的尿液处理和标准化解决方案，用于EV生物标志物研究和常规临床取样和诊断的无偏读数，为设计更大的验证研究提供了输入，将尿液EV用作特定条件和疾病的生物标志物。
尿液是一系列临床条件的潜在有价值的诊断标记物的吸引人且易于接受的来源，尤其是那些影响泌尿生殖道的疾病，如肾脏疾病或损伤，以及泌尿生殖系统癌症。此外，尿液生物标记物也显示出潜在的非泌尿病理学，例如其他癌症（如乳腺癌或肺癌）、代谢和内分泌疾病（如糖尿病）、炎症状况（如动脉粥样硬化和骨关节炎），甚至神经变性或神经精神疾病。使用尿液测试来诊断疾病是一种古老的做法（例如，通过品尝或吸引蚂蚁来检测糖尿病患者的葡萄糖，或通过“泡沫测试”来检测白蛋白作为肾脏疾病的指标），并且在整个20世纪和21世纪初一直是研究医学的基础组成部分。随着现代组学技术的出现，大量的尿液成分被揭示出来，其定量和定性改变有望在临床领域具有诊断和预测价值。
矛盾的是，尿液作为一种完全无创的液体活检生物标志物来源，可用于纵向诊断和监测，目前仍缺乏研究。这种悖论是由于这种生物流体的特殊特性，以及方法学障碍仍然妨碍生物标记候选物获得验证和诊断分析实施的定量特权。
与成分和体积受到严格调节的血液不同，尿液不受稳态机制的影响。尿液是一种独特的生物流体，其pH值、渗透压、组成和分散溶质的浓度都可能变化，即使在同一个人内，也可能超过数小时或数天。成人的尿液产量在正常范围0.6-2.6升之间变化，活性或环境因素阻碍了对生物标志物进行严格定义的客观测量。尿生物标志物的可靠鉴定和评估可能受益于可靠和特异的平台，该平台有望更好地确定生物标志物来源（在组织或疾病特异性方面），无论是在可溶性还是固态尿相。字母包括沉淀物（典型的脱落细胞）和细胞外囊泡（EV）。
EV有望作为细胞特异性特征的载体，封装并稳定稀有但信息丰富的生物标志物物种（蛋白质、聚糖、核酸、脂质、代谢物）。研究尿EV生物标记物潜力的早期科学进展主要集中在泌尿生殖道癌症上，后来激发了对其他泌尿生殖系统病理学的尿EV生物学标记物的探索。事实上，第一个也是唯一一个基于EV的商业级诊断试剂盒IntelliCore于2018年由Exosome Diagnostics开发并推出，基于对尿样中定义的EV mRNA组的评估。在前瞻性多中心研究中，该试验对晚期前列腺癌和惰性前列腺癌患者分层的有效性得到了广泛验证。今天，同一研究小组正在应用类似的概念开发和验证一种新的基于EV-RNA的无创性移植排斥试验。然而，对于过去几年针对不同病理学描述的大量尿EV候选生物标记物，尚未完成显著验证，研究之间的比较仍然极具挑战性。目前的共识是，EV分离和分析的一些方法学方面，包括临床前处理和结果标准化，仍然存在，需要进行优化和标准化，以促进将科学发现转化为临床实践。
虽然EV广泛存在于尿液中，但相对于更丰富的分泌蛋白（如尿调节蛋白），EV的浓度较低。事实上，在蛋白质组学研究中，尿调节蛋白被发现是污染EC制剂的最丰富的蛋白质。污染程度取决于先证者样本和使用的EV纯化方法。尽管被认为是尿EV提取效率的技术挑战，但尿调节蛋白污染并未显示出枪炮蛋白质组学中其他丰富EV蛋白的显带明显减少，也不会干扰EV尿RNA货物的分析。