作者：杜柏果 北京市朝阳区六里屯社区卫生服务中心(北京城建老年病医院)

统计分析使用微软Excel进行计算。使用GraphPad Prism软件进行统计分析。对于每个数据集，至少考虑了三个独立的实验，所有数据都显示为平均± SEM。数据分析采用单向方差分析，然后采用Dunn、Tukey或Dunnet事后测试，当样本不遵循正态分布时，使用非参数检验。
我们小组的感谢工作由法国抗肌病协会、法国国家研究机构、国家癌症研究所、医学研究基金会（FRM）资助，Labex，Idex USPC（“神经突生长中的传统和非常规分泌”）给TG。我们感谢法国生物成像协会（ANR-10-INBS-04）的成员雅克·Monod研究所的核心设施的服务。我们感谢IPNP的NeurImag和B&B技术核心设施提供的技术支持。我们感谢Leducq基金会资助了LEICA TCS SP8系统。
Sec22b和Stx与脂质转移蛋白E-Syt2和E-Syt3相互作用。从HeLa细胞裂解物中提取GFP-Trap下拉后恢复的物质的免疫印迹。在eGFP-Stx3或eGFP（阴性对照）存在的情况下，细胞被转染为FLAG-E-Sec22b和Myc-E-Syt2)或FLAGSec22b和Myc-E-Syt3 的共表达。细胞裂解物进行GFP-Trap下拉。对总细胞裂解液（输入）和捕获材料（结合）进行SDS-PAGE和Western印迹处理。用针对标签的抗体进行印迹检测。Myc-E-Syt2和Myc-E-Syt3都被eGFP-Stx3选择性地招募。在共同表达Myc-E-Syt2或Myc-E-Syt2SMP的细胞中，使用Sec22b-pHL作为诱饵的 GFP-Trap基质结合材料所示抗体进行处理。Stx-大鼠胚胎皮质1/3免疫沉淀。以初代兔igg为阴性对照。对总细胞裂解液（Input）和免疫沉淀物（IP）进行SDS-PAGE和Western印迹处理。用针对内源性蛋白的抗体进行印迹检测。Stx1/3如预期的那样共免疫沉淀Sec22b和E-Syt2。从ngf处理的PC12细胞裂解液中GFP-Trap下拉后恢复的免疫印迹。转染细胞共表达Myc-E-Syt2和上述GFP标记的SNAREs，并按照A-C的方法进行处理。印迹显示了针对上述6个靶蛋白的抗体只有Sec22bpHL，而不是其长时间删除的版本Sec22bL-pHL或其他测试的SNAREs，可以招募Myc-E-Syt2。以eGFP的GFP-Trap下拉作为非特异性结合的对照。定量由免疫沉淀的GFP标记的vSNAREs和tSNAREs给出的Myc-E-Syt2信号与GFP信号之间的比值。定量Myc-E-Syt2信号与GFP信号之间的比率和内源性SNAP25信号与GFP信号之间的比率，由免疫沉淀的Sec22b-pHL与Sec22bL-pHL提供。单因素方差分析和Dunnett的多重比较后检验，P<0,05*，P<0,001***，n= 3个独立实验。误差条表示扫描电镜。 E-Syt2和Sec22b在神经突起和生长锥中大量接近。在HeLa细胞和3DIV海马神经元.中进行了原位蛋白相互作用的双链近距离连接实验（PLA）使用小鼠抗sec22b、兔抗e-syt2或兔抗钙联蛋白的指示抗体组合的代表性共聚焦。阴性对照包括仅使用抗sec22b或抗e-syt2抗体。在每个场中，进行包括整个细胞在内的共聚焦z堆栈的最大强度投影，以观察PLA点的最大数量。细胞核用DAPI染色。A1-4，PLA点。C1-3，PLA点。C4-6，MAP2免疫荧光染色叠加在C1-3中显示的区域上。PLA的定量以每个HeLa细胞的点表示，在3DIV海马神经元中，以神经突、生长锥或细胞体中每µm2表面积的点表示。在HeLa和神经元中，Sec22b-E-Syt2对的个体荧光点数量高于Sec22b-钙联蛋白对或阴性对照。与神经元的细胞体相比，神经突起和生长锥的含量更高。单因素方差分析后，Dunn的多重比较后检验，P<0,05*，P < 0.001***。n.=，3个独立实验。误差条表示扫描电镜。
使用超分辨率显微镜分析E-Syt2 / Sec22b共定位。标记为内源性E-Syt2和Sec22b-pHL和质膜的3DIV海马神经元的代表性共聚焦图像。AlexaFluor®488偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）用于标记质膜)中插图的超分辨率（3D STED）三维重建显示了内源性E-Syt2和Sec22b-pHL在生长锥中的定位。使用Ripley函数（冰SODA插件）通过空间分布分析评估(C)的统计关联。Sec22b和E-Syt2粒子的三维STED重建。矩形表示重叠斑点的例子：与ESyt2统计相关的Sec22b为黄色；E-Syt2统计相关的Sec22b为橙色拓扑方案，说明了相关的Sec22b-E-Syt2斑点与PM之间的测量距离。估计为4229个簇的4个不同生长锥的67.12nm+/-1.22平均值，其中位数为： 33.6nm，表明50%的簇位于距离≤d=33.6nm，与ER-PM接触位点兼容。
如果假设发生融合，则PM中结构拓扑的方案。表面染色与总染色的定量分析，以GFP-Sec22b的标准化比率表示。Onewaa分析P<00001***，Dunn的多重比较后检验标记在图上。表达Sec22b-HA或Sec22bL-HA的COS7细胞的代表性图像，并用抗HA抗体标记。值得注意的是，在Sec22bL突变体中，Sec22b的典型网状定位部分丢失。