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海马神经元转染细胞的实验数据分析

海马神经元转染细胞的实验数据分析 妙手医生2022-11-14 1028次阅读
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作者:翟夷 北京市朝阳区六里屯社区卫生服务中心(北京城建老年病医院)

在未转染或过表达eGFP-E-Syt3的HeLa细胞和同时表达细胞科学杂志接受的靶向E-Syt1和E-Syt3的HeLa细胞中进行双链接近连接实验(PLA)蛋白相互作用。具有代表性的共聚焦图像显示了Sec22b(小鼠抗Sec22b)和Stx3(兔抗Stx3)之间的PLA。阴性对照结合IgG2a和IgGR。在每个场中,进行包括整个细胞在内的共聚焦z堆栈的最大强度投影,以观察PLA点的最大数量。细胞核用DAPI染色。共聚焦最大投影图像显示Sec22b-Stx3 PLA信号与e-syt3阳性的皮质ER共定位。PLA的定量以每个HeLa细胞的点表示。与未转染的细胞或阴性对照的相比,表达eGFP-E-Syt3的细胞中单个荧光点的数量更高与表达siCtrl的细胞相比,在表达靶向三种E-Sys亚型的sirna的细胞中,它较低。数据用均值± SEM表示。Oneway方差分析P<0,05*,Dunn的多重比较后检验。n.=,3个独立实验。来自表达靶向三种E-Sys亚型的sirna的HeLa细胞裂解物的代表性免疫印迹。以微管蛋白作为加载对照。E-Syts过表达促进了发育中的神经元中丝状伪足的形成和分支
表达MycE-Syt2的核感染的3DIV海马神经元的代表性形态。用eGFP共表达来观察细胞的形状。高倍图像显示细胞科学杂志接受的手稿在轴突的一部分。比例尺,10µm。Myc-E-Syt2突变型的表达。3个DIV神经元共同表达eGFP和Myc-E-Syt2或其中一个缺失突变体Myc-E-Syt2SMP和Myc-E-Syt2MSD,分别缺乏SMP结构域和跨膜区。以空的Myc载体作为阴性对照。转染神经元形态学参数的量化。eGFP通道的最大强度投影。值得注意的是,与最长的神经突长度相比,表达Myc-E-Syt2的神经元中每个神经元的分支数和总神经突长度增加,而表达突变体没有影响。数据用均值± SEM表示。Oneway分析了P<0,001***,邓恩的多重比较后检验标记在图上。n.=,3个独立实验。 E-Syts过表达刺激HeLa细胞的细胞膜生长,转染 HeLa细胞,共表达Myc-E-Syt2和eGFP(后者用于描述细胞形状)。高倍图像显示细胞周围丝状伪足。 HeLa细胞共同表达eGFP和Myc-E-Syt2或缺失突变体Myc-E-Syt2SMP和Myc-E-Syt2MSD之一。以空的Myc载体作为对照。转染细胞中显示的峰值面积的定量,来自eGFP通道z堆栈的最大强度投影。它以细胞总表面积的百分比表示。与表达突变蛋白的细胞相比,表达Myc-E-Syt2的细胞中丝状伪足的形成增强。数据用均值± SEM表示。Oneway方差分析P<0,01**,Dunn的多重比较后测标记在图上。n.=,3个独立实验。E-Syts介导的形态发生效应依赖于Stx1,bont在神经元陷阱靶标上的切割位点,切割可以发生在SNAP25SNAP25和Stx1上,也可以发生在VAMP2上。bont的裂解活性。暴露于1nMbont4小时的神经元裂解液的代表性免疫印迹。从b中获得ECL信号的定量。绘制了SNAREs与微管蛋白的比值。Onewaa分析P<0,05*,然后进行事后Tukey HSD测试。n.=,3个独立实验。数据用均值± SEM表示。 3DIV海马神经元共表达Myc-E-Syt2和eGFP,并用bont处理。对处理后的神经元的形态测量参数的量化,测量eGFP通道的z堆栈的最大强度投影。BoNT/C1对Stx1的特异性切割减少了表达Myc-E-Syt2的神经元的分支数量和总神经突长度。数据用均值± SEM表示。P<0,01** P<0,001 ***,Dunn的多重比较后检验标记n.=,3个独立实验。E-syts介导的形态发生效应依赖于ER到PM的距离。方案显示了在Sec22b中预测的多聚脯氨酸拉伸插入对ER-PM距离的预测效应。海马神经元共同表达Myc-E-Syt2和GFP-Sec22b、GFP-Sec22b-P33突变体或Sec22b GFP-Longin结构域,在3DIV处观察到。对处理神经元的形态参数进行量化,测量GFP通道z堆的最大强度投影。《细胞科学杂志》认为,在表达GFP-Sec22b-P33突变体的神经元或GFP-Longin结构域中,过表达Myc-Esyt2对分支数量和神经突长度总和的影响减少。数据用均值± SEM表示。
Sec22bLongin突变体到达细胞表面3DIV的海马神经元转染Sec22b或Sec22bc22bL突变体,如果Sec22b室与PM融合,则在培养基中通过抗-GFP抗体检测到。n端标记的Sec22b被用作阴性对照,因为其GFP标签不应该暴露在细胞外,用抗GFP抗体检测,即使在膜融合的情况下。以VAMP2-pHL作为融合术的阳性对照。为了进行表面染色,允许抗GFP抗体在4°C下结合10 min,固定神经元并进行免疫化学处理。如果假设发生融合,则PM中结构拓扑的方案。表面染色与总染色的定量分析,以GFP-Sec22b的标准化比率表示。Onewaa分析P<00001***,Dunn的多重比较后检验标记在图上。表达Sec22b-HA或Sec22bL-HA的COS7细胞的代表性图像,并用抗HA抗体标记。值得注意的是,在Sec22bL突变体中,Sec22b的典型网状定位部分丢失。

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