作者：仲崇星 北京丰台医院(桥南部)

摘要
嵌合抗原受体(CAR) T细胞的过继转移在血液肿瘤中表现出无与伦比的反应，然而抗原逃逸和肿瘤复发经常发生。由于免疫抑制肿瘤环境和抗原异质性，实体瘤患者的CAR T细胞治疗面临更大的挑战。在这里，我们开发了一种双特异性CAR，同时靶向上皮细胞粘附分子(EpCAM)和细胞间粘附分子1 (ICAM-1)，以克服抗原逃逸并改善肿瘤反应的持久性。ICAM-1是一种粘附分子，可被炎性细胞因子诱导，并在多种类型的肿瘤中升高。我们的研究证明了双特异性CAR T细胞比靶向单一初级抗原的CAR T细胞更有效。双特异性CAR T在EpCAM同源或异源表达的肿瘤模型中实现了更持久的抗肿瘤反应。我们还发现，肿瘤中针对EpCAM的CAR T细胞的激活导致ICAM-1的上调，这使得肿瘤对双特异性CAR T细胞靶向ICAM-1更敏感。我们的额外靶向ICAM-1的策略可能在增强CAR T细胞针对易于抗原丢失或下调的原发性肿瘤抗原的活性方面具有广泛的应用。
介绍
嵌合抗原受体(CAR) T细胞疗法是一种快速出现的免疫疗法，其使用合成抗原受体(1, 2).CAR T细胞的过继转移在一系列B细胞白血病和淋巴瘤中产生了显著的反应，其中所有其他治疗选择已经用尽(3–5).早期临床试验结果也表明CAR T细胞疗法对复发或难治性多发性骨髓瘤(6, 7).尽管抗CD19 CAR T细胞的初始应答率很高，但是，在约30%至50%的缓解患者中观察到复发，包括细胞表面抗原减少或完全丧失，通常在治疗的1年内(8–10).还报道了与抗原丢失相关的复发，其中CARs针对其他靶标，如CD22和B细胞成熟抗原(BCMA)，强调抗原逃逸是CAR T细胞治疗成功的重要和常见障碍(6, 7, 11).除了血液肿瘤之外，抗原逃逸可能是针对实体瘤的CAR T细胞疗法的更大挑战，实体瘤通常由具有异质抗原表达的细胞.
避免抗原逃逸的一种特殊策略是同时靶向多种肿瘤抗原，从而降低复发的风险。一项使用双特异性CD19–CD20 CAR T细胞的I期临床试验已证明对复发的难治性B细胞恶性肿瘤具有显著疗效(15).串联CD19–CD22和CD19–CD 123 CAR T细胞也显示出在临床前模型中增强T细胞功能和减少抗原逃逸(11, 16)，CD19–CD22汽车目前正在进行人体测试(ClinicalTrials.gov识别号:NCT03241940和NCT03448393)。同样，多特异性靶向已被证明有可能克服实体瘤中的抗原异质性。例如，可以同时靶向HER2和IL13Rα2的串联CAR减轻了抗原逃逸，并显示出比具有单一特异性CAR的T细胞、合并的CAR T产物或共表达两种独立CAR的T细胞(17).因此，多特异性靶向可能提供一种克服抗原逃逸的有效方法，并可能给该领域带来重大进展。
ICAM-1是具有细胞因子诱导性质的跨膜糖蛋白，长期以来已知其在促进白细胞内皮迁移(18, 19).ICAM-1在内皮细胞和白细胞上以低水平组成性存在；然而，在炎症介质如IL1、IFNγ、TNFα和脂多糖(19).当上调时，白细胞上的ICAM-1和淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)之间的相互作用促进了白细胞从循环中的固定和外渗。已经在各种类型的肿瘤和相关基质中观察到ICAM-1过表达(20–22)并与肿瘤发展和药物抗性有关(23, 24).使用单克隆抗体的临床研究表明ICAM-1靶向治疗的适用性和耐受性(25, 26).此前，我们开发了一款低亲和力汽车(F292A汽车，Kd≈ 20 μmol/L)，这使得CAR T细胞对具有过表达抗原的肿瘤具有选择性，同时保留具有基础表达的正常细胞(27, 28).目前正在评估这些微摩尔亲和力ICAM-1 CAR T细胞在晚期甲状腺癌患者中的安全性和初步疗效(NCT04420754)。
为了扩大针对其他适应症和肿瘤抗原的CAR T细胞疗法，我们选择了一种称为EpCAM的分子作为肿瘤靶抗原，并使用先前分离的称为UBS54(29).EpCAM是一种表面抗原，已发现其在多种癌症中频繁上调，包括结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌和子宫内膜癌(30).为了开发更能抵抗抗原逃逸的CAR T细胞，我们试图产生一种能同时靶向EpCAM和ICAM-1的双特异性CAR。我们假设，由于炎性T细胞因子对ICAM-1的诱导性，用ICAM-1的额外靶向补充EpCAM CAR，将提高CAR T细胞对EpCAM过度表达肿瘤的疗效，并防止抗原阴性变异体的免疫逃避。我们的数据表明，单独的EpCAM特异性CAR T细胞能够有效根除多种实体瘤，但易复发。相比之下，额外靶向ICAM-1的双特异性双CAR T细胞显示了预防肿瘤耐药或减少异源EpCAM表达肿瘤复发的潜力。添加ICAM-1靶向显著提高了CAR T细胞的抗肿瘤活性，即使在治疗前肿瘤几乎没有ICAM-1表达。我们发现，ICAM-1可被CAR与主要抗原(即EpCAM)相互作用时分泌的促炎细胞因子诱导，使肿瘤细胞更易受双重CAR T细胞的攻击。
材料和方法
细胞培养
人类胶质母细胞瘤细胞系U-251(由B. Law，Weill Cornell Medicine，New York，NY赠送)和人类甲状腺癌细胞系8505C于2018年从适马购买。胃癌细胞系MKN-45于2016年从DSMZ购买，而SNU-638于2018年从韩国细胞系库(韩国首尔首尔国立大学)获得。人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和SK-BR-3(由J. Babich，Weill Cornell Medicine，New York，NY赠送)、胰腺癌细胞系SW-1990和Capan-2、结肠癌细胞系HT-29、胃癌细胞系Hs 746T、293T和Jurkat细胞系从2018年至2020年从ATCC购买。U251、MDA-MB-231、SW-1990、Hs 746T和293T在补充有10% FBS的DMEM(康宁)培养；SK-BR-3、Capan-2和HT-29保持在含有10% FBS的McCoy的5A (ATCC)中；8585C、MKN-45和SNU-638保持在补充有10% FBS的RPMI1640(康宁)中。用萤火虫荧光素酶-F2A-GFP (FLuc-GFP)慢病毒(Biosettia)转导所有肿瘤细胞，用于基于生物发光的细胞毒性和小鼠成像实验。2019年从Cell Biologics，Inc .获得了通过使用EpCAM特异性抗体的磁激活细胞分选分离的人原代结肠(H-6047)、肾(H-6034)和肝(H-6044)上皮细胞，并根据供应商的建议将其维持在完整的人上皮细胞培养基(Cell Biologics，Inc .，目录号H6621)中。所有细胞都在37℃、含5% CO的湿润培养箱中培养2并使用MycoAlert检测试剂盒(Lonza)对支原体进行常规检测。细胞系被用于在试管内和在活生物体内最多20次传代的实验，而原代上皮细胞用于三次传代内的测定。
CRISPR–cas 9细胞系编辑
根据制造商的说明，使用Alt-R CRISPR-Cas9系统(Integrated DNA Technologies，Inc .)产生EPC am-敲除细胞系。通过在95℃加热5分钟，然后逐渐冷却至室温，使反式激活的CRISPR RNA(TRAC RNA)和CRISPR RNA (crRNA)寡聚物在等摩尔浓度下退火。用两个crRNA分别针对EpCAM的两个外显子:crRNA-AA，5′-rg raru rCrArC rArArC rGrCrG ruura rur CRA rarc rg ruru ru rur arg rar GRC rura ru rgr cru-3′；crRNA-AB，5′-rGrUrG rCrArC rCrArA rCrUrG rArArG rur arc rarc rg ruru rur arg rur GRC rur arg rur rur rgru-3′。然后将指导RNA双链体(22 pmol)与Cas9核酸酶(18 pmol)在室温下孵育20分钟以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。总共5 × 10四将细胞与RNP-AA和RNP-AB复合物混合到10 μL氖尖中。每次电穿孔的最终浓度为1.8 μmol/L gRNA-AA、1.8 μmol/L gRNA-AB和1.5 μmol/L Cas9核酸酶。使用Neon转染系统(Invitrogen)进行电穿孔(1，250 V/20 ms/3脉冲)后，立即将细胞转移到含有0.5 mL预热培养基(RPMI，10% FBS)的24孔板中，并在湿润的37 ℃, 5% CO2孵化器。五天后，通过流式细胞术评估细胞表面的EpCAM表达(详情见“流式细胞术”一节)。
慢病毒载体构建
合成EpCAM特异性CAR构建体和阴性对照BCMA CAR构建体，并通过GenScript将其克隆到慢病毒质粒骨架(VectorBuilder Inc .，Vector Design Studio)中，在人延伸因子1α (EF1α)启动子的调控下。EpCAM特异性单链抗体含有来源于抗EpCAM单克隆抗体UBS54(29)，而BCMA特异性CAR含有来源于J22.9-xi抗体的scFv(31).将scFv的编码序列插入到第二代CAR构建体中，该构建体从5′-LTR端开始包含:EF1α启动子、信号序列、c-Myc标签、scFv、CD8铰链区、CD28的跨膜区和胞质区以及CD3ζ的胞质区。PET报告基因SSTR2在CAR后按照“自我切割”核糖体跳过猪teschovirus-1 2 A (P2A)序列掺入。对于双顺反子双CAR，UBS54 scFv被附加到CD28–cd3ζ，而F292A I结构域被附加到4-1BB–cd3ζ。在每个CAR的N末端引入c-Myc或Flag标签，用于检测CAR表达。这两种car通过P2A和亚洲2A病毒(T2A)核糖体跳过序列与SSTR2在三顺反子构建体中共表达。
汽车T细胞制造
慢病毒由VectorBuilder包装，并在80°C下冷冻直至使用。Jurkat T细胞通过以1∶25稀释度与慢病毒一起过夜孵育来转导，并且CAR的表达在3天后通过流式细胞术来验证。2018年至2019年期间，从Biological Specialty Corporation商业获得了来自四名健康供体的人类白细胞。通过使用人CD4 (Miltenyi Biotec，目录号130-045-101)和人CD8 (Miltenyi Biotec，目录号130-045-201)微珠的磁激活细胞分选，富集t细胞以获得%3E95%的CD3纯度。用人T-激活剂CD3/CD28 Dynabeads (Gibco)以1∶1的珠细胞比激活CD4/CD8-富集的T细胞，并在完全T-细胞生长培养基:含有5%人AB血清(适马)、IL7(12.5 ng/mL；Miltenyi Biotec)和IL15 (12.5纳克/毫升；Miltenyi Biotec)。在激活后24和48小时，用慢病毒(1∶25稀释)进行两次t细胞转导。t细胞在50毫升生物反应器管(TubeSpin，TPP)中以1-3×10进行扩增6在设置为5 rpm的管辊(Thermo Fisher Scientific)上的细胞/mL。在T细胞活化后的第6至7天，通过流式细胞术评估转导效率。在第10天，将细胞产物冷冻保存在T细胞完全生长培养基和CS10(干细胞)的1∶2混合物中在试管内和在活生物体内实验。