作者：李东 北京市朝阳区团结湖社区卫生服务中心

细菌基因组的无标记基因工程通常采用两步同源重组方法，利用携带目的基因侧翼区域的载体进行位点特异性载体整合和反选择标记，为第二步重组提供正选择压力，从而导致载体切除。在此，我们提供了一种新的反选择方法的原理证明，该方法利用杀菌和抑菌抗生素之间的拮抗活性，并通过选择性杀死保留抗生素选择标记的细菌，为第二个重组步骤提供选择压力通过筛选杀菌氨基糖苷类卡那霉素、链霉素和庆大霉素联合抑菌抗生素氯霉素和红霉素的拮抗活性，对单核增生李斯特菌和脑膜炎奈瑟菌进行了优化。当红霉素、庆大霉素和ermC联合作为抗生素选择标记时，对含有抗生素选择标记的单核增生乳杆菌和脑膜炎奈瑟菌的选择性杀伤差异最大。因此，该组合被用来产生两个无标记缺失突变体的单核增生乳杆菌和脑膜炎。在第二步重组中对培养物施加双抗菌选择压力后，将存活的菌落复制镀在含和不含红霉素的琼脂上。平均而言，12-13%的随机选择的菌落由于第二次重组事件而失去了选择标记，其中大约一半的菌落是所期望的无标记的帧内缺失突变体。因此，该方法被证明是简单、快速的，并应适用于多种细菌种类。
基因工程和从细菌基因组中的基因缺失是研究基因功能和调控的基础。染色体区域的缺失通常是通过与抗生素耐药性标记进行同源重组，该标记的两侧是与靶标的上、下游区域对应的序列。然而，这种方法有很大的局限性，因为抗生素耐药性标记物可能会影响邻近基因的表达，特别是当靶基因是操纵子的一部分时。此外，对于许多细菌，只有有限数量的抗生素耐药性标记可用，当需要多个染色体修饰时，这可能会有问题。因此，构建基础无标记缺失突变体的方法为这些局限性提供了一个解决方案。
无标记缺失突变体通常通过双步重组方法产生。携带靶基因上下侧翼区域的非复制或温度敏感质粒是通过单次交叉重组特异性整合到细菌染色体中的第一个位点。在随后的自发的第二次重组事件中，积分向量被切除，
产生野生型的原始基因组或所需的突变体。由于抗生素耐药性标记的加入，第一次重组事件的选择很简单，但由于自发质粒切除率较低，第二次重组事件的选择通常需要对大量的单个菌落进行广泛的筛选。因此，为了为第二次重组事件提供积极选择，已经开发了多种反选择标记，包括rpsL。然而，许多这些反选择标记与不同细菌种类的相容性受到限制，或者需要对细菌基因组进行初始改变。此外，sacB反选择标记仅在不能代谢蔗糖聚合物的物种中起作用。在这里，我们报道了一种新的反选择方法的发展，它不需要任何额外的选择标记或目标细菌的基因组改变，也不需要用于选择第一个重组事件的抗生素耐药性标记。这种方法依赖于一些抑菌抗生素对杀菌抗生素的拮抗作用，这些杀菌抗生素专门针对并杀死积极复制的细菌。因此，当抗生素耐药性标记对抑菌抗生素用于选择第一个重组事件和细菌随后暴露于这种抑菌抗生素和杀菌抗生素，细菌保留抗生素耐药性标记将选择性地杀死杀菌抗生素，因为他们能够复制，而细菌失去了抗生素耐药性标记在第二个重组事件将生存由于生长抑制抑菌抗生素。利用这一策略，我们在构建单核增生李斯特菌和脑膜炎奈瑟菌的无标记框内缺失突变体时，成功地选择了第二次交叉重组事件。
材料和方法脑膜炎奈瑟菌ATCC13090、单核增生乳杆菌EGDe（ATCC BAA-679）及其衍生物保存在−含15%甘油（BHI）（−80°C）。为了启动所有实验，脑膜炎奈瑟菌菌株在含有5%（卷/卷）马血清（SBJ-Bio）和1 mg/L可溶性淀粉的BHI琼脂上培养过夜，而单核增生乳杆菌菌株在37°C的BHI琼脂上生长。